Амплисенс энтеровирус fl инструкция

ИНСТРУКЦИЯ

по
применению набора реагентов

для
выявления РНК энтеровируса 71 типа
(Enterovirus
71 типа) в объектах окружающей среды и
биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс^®
Enterovirus 71-FL»

АмплиСенс^

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей инструкции
применяются следующие сокращения и
обозначения:

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов
«АмплиСенс^®
Enterovirus 71-FL»
предназначен для выявления РНК
энтеровируса 71 типа (Enterovirus
71 типа) в биологическом материале (у лиц
с подозрением на энтеровирусную инфекцию
вне зависимости от формы и наличия ее
манифестации) и объектах окружающей
среды методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией продуктов амплификации.

Материалом для проведения
ОТ-ПЦР служат образцы РНК, экстрагированные
из различных типов биологического
материала (спинномозговая жидкость,
образцы фекалий) и образцов объектов
окружающей среды (концентраты образцов
воды) в соответствии с МУ 3.1.1.2363-08
«Эпидемиологический надзор и профилактика
энтеровирусной (неполио) инфекции».

ВНИМАНИЕ! Результаты
ПЦР-исследования учитываются в комплексной
диагностике заболевания¹⁾.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Выявление РНК энтеровируса
71 типа (Enterovirus
71 типа) методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
включает в себя два этапа: экстракцию
РНК из исследуемых образцов и объединенный
этап обратной транскрипции РНК и
амплификации участка кДНК с
гибридизационно-флуоресцентной
детекцией, которая производится либо
непосредственно в ходе ПЦР (формат FRT),
либо после ее завершения (формат FEP).
Экстракцию РНК из биологического
материала и образцов объектов окружающей
среды проводят в присутствии внутреннего
контрольного образца (ВКО
STI-87-rec),
который позволяет контролировать
выполнение процедуры исследования для
каждого образца. Пробы
РНК используют для проведения реакции
обратной транскрипции и амплификации
участка кДНК энтеровируса 71
типа
при помощи фермента Taq-полимеразы
и специфичных к этому участку праймеров.
В составе реакционной смеси присутствуют
флуоресцентно-меченые
олигонуклеотидные зонды, которые
гибридизуются с комплементарным участком
амплифицируемой кДНК-мишени, в результате
чего происходит нарастание
интенсивности флуоресценции.
Это позволяет регистрировать накопление
специфического продукта амплификации
путем измерения интенсивности
флуоресцентного сигнала.
Детекцию
флуоресцентного сигнала
при использовании
формата FEP осуществляют
после окончания ПЦР с помощью
флуоресцентного ПЦР-детектора, а при
использовании формата FRT – непосредственно
в ходе ПЦР с помощью амплификатора с
системой детекции флуоресцентного
сигнала в режиме «реального времени».

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ

Набор реагентов
выпускается в 1 формате.

Формат FEP/FRT

Набор реагентов
выпускается в 2 формах комплектации:

Форма 1
включает комплект
реагентов «ПЦР-комплект» вариант
FEP/FRT-50
F.

Форма
2
включает наборы реагентов оптом,
расфасованные по отдельным реагентам,
с маркировкой реагентов на их оптовой
фасовке.

Форма комплектации 1
предназначена для
проведения реакции обратной транскрипции
РНК и амплификации фрагмента кДНК
энтеровируса 71
типа (Enterovirus
71 типа) с
гибридизационно-флуоресцентной
детекцией по «конечной точке», либо в
режиме «реального времени». Для проведения
полного ПЦР-исследования необходимо
использовать комплекты реагентов для
экстракции РНК,
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора («РИБО-сорб», «РИБО-преп»
или аналогичные).

Форма комплектации 2
предназначена для производственных
целей для последующей маркировки на
языке заказчика и комплектации по
наборам.

ВНИМАНИЕ! Форма
комплектации 2 используется только в
соответствии с регламентом, утвержденным
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Аналитическая
чувствительность

Аналитическая
специфичность

Специфичность набора
реагентов проверялась на следующих
штаммах микроорганизмов: энтеровирусов
человека (представителей разных
генетических кластеров – Human
echovirus 2, 6, 9, 11, 14,
15, 16, 17, 18, 30; Human
coxsackievirus A4,
A5,
A6,
A9,
A16,
B4,
B5,
Human
poliovirus
1, 2, 3 (Sabin1,
Sabin2,
Sabin3));
вирусов гриппа А (H23N2,
H9N2,
H8N4,
H3N3,
H5N6,
H21N6,
H22N5,
H4N8,
H2N1,
H6N2,
H20N7,
H6N1),
В, риновирусов, RS
вирусов, аденовирусов человека – 3, 5,
7, 37, 40, 41 типов (клинические изоляты,
специфичность подтверждена прямым
секвенированием нуклеотидных
последовательностей); штаммах
микроорганизмов и образцах ДНК – ДНК
человека, штаммах Acinetobacter
baumanii
ATCC^®
19606™, Bacteroides
fragilis
ATCC^®
25285™, Bordetella
bronchiseptica
ATCC^®
10580™, Bordetella
bronchiseptica
ATCC^®
4617™, Bordetella
pertussis
ATCC^®
9340™, Candida
albicans
ATCC^®
14053™, Candida
guilliermondii
ATCC^®
6260™, Candida
krusei
ATCC^®
14243™, Clostridium
difficile
ATCC^®
9689™, Clostridium
septicum
ATCC^®
12464™, Corynebacterium
jeikeium
ATCC^®
43734™, Corynebacterium
xerosis
ATCC^®
373™, Eggerthella
lenta
(Eubacterium
lentum)
ATCC^®
43055™, Enterobacter
aerogenes
ATCC^®
13048™, Enterobacter
cloacae
ATCC^®
13047™, Enterococcus
faecalis
ATCC^®
29212™, Enterococcus
faecalis
(vancomycin
resistant)
ATCC^®
51299™, Enterococcus
faecium
ATCC^®
35667™, Erysipelothrix
rhusiopathiae
ATCC^®
19414™, Escherichia
coli
ATCC^®
25922™, Escherichia
coli
ATCC^®
35218™, Fluoribacter
(Legionella)
dumoffii
ATCC^®
33279™, Haemophilus
infuenzae
ATCC^®
33930™, Haemophilus
influenzae
ATCC^®
9006™, Haemophilus
influenzae
ATCC^®
10211™, Haemophilus
parainfluenzae
ATCC^®
7901™, Klebsiella
oxytoca
ATCC^®
49131™, Klebsiella
pneumoniae
ATCC^®
27736™, Legionella
pneumophila
ATCC^®
33152™, Listeria
grayi
(murrayi)
ATCC^®
25401™, Listeria
innocua
ATCC^®
33090™, Listeria
monocytogenes
ATCC^®
7644™, Moraxella
(Branhamella)
catarrhalis
ATCC^®
25238™, Moraxella
(Branhamella)
catarrhalis
ATCC^®
8176™, Neisseria
meningitidis
ATCC^®
13102™, Neisseria
meningitidis
ATCC^®
13090™, Neisseria
lactamica
ATCC^®
23970™, Neisseria
gonorrhoeae
ATCC^®
19424™, Neisseria
gonorrhoeae
ATCC^®
49926™, Peptoniphilus
(Peptostreptococcus)
anaerobius
ATCC^®
27337™, Proteus
mirabilis
ATCC^®
12453™, Proteus
vulgaris
ATCC^®
6380™, Propionibacterium
acnes
ATCC^®
11827™, Pseudomonas
aeruginosa
ATCC^®
15442™, Rhodococcus
equi
ATCC^®
6939™, Salmonella
enterica
subsp.
enterica
serovar
Typhimurium
ATCC^®
14028™, Serratia
marcescens
ATCC^®
14756™, Staphylococcus
aureus
ATCC^®
6538P™,
Staphylococcus
aureus
(MRSA)
ATCC^®
43300™, Staphylococcus
aureus
ATCC^®
29213™, Staphylococcus
aureus
ATCC^®
25923™, Staphylococcus
aureus
ATCC^®
33862™, Staphylococcus
aureus
(MRSA)
ATCC^®
33591™, Staphylococcus
aureus
subsp.
aureus
ATCC^®
12600™, Staphylococcus
epidermidis
ATCC^®
12228™, Staphylococcus
haemolyticus
ATCC^®
29970™, Staphylococcus
saprophyticus
ATCC^®
49907™, Stenotrophomonas
maltophilia
ATCC^®
13637™, Streptococcus
agalactiae
ATCC^®
12386™, Streptococcus
agalactiae
ATCC^®
13813™, Streptococcus
equisimilis
ATCC^®
12388™, Streptococcus
equi
subsp.
equi
ATCC^®
9528™, Streptococcus
bovis
(Group
D)
ATCC^®
9809™, Streptococcus
mutans
ATCC^®
35668™, Streptococcus
pneumoniae
ATCC^®
49619™, Streptococcus
pneumoniae
ATCC^®
6303™, Streptococcus
pneumoniae
ATCC^® 27336™,
Streptococcus pneumoniae
ATCC^®
6305™, Streptococcus
pyogenes ATCC^®
19615™, Streptococcus
salivarius ATCC^®
13419™, Streptococcus
uberis ATCC^®
700407™, Trichophyton
mentagrophytes ATCC^®
9533™, Vibrio
parahaemolyticus ATCC^®
17802™, Vibrio vulnificus
ATCC^®
27562™, Moraxella
catarrhalis ATCC^®
25240™. При проведении тестирования данных
панелей, а также образцов ДНК человека,
неспецифических реакций выявлено не
было.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Сравнительные
характеристики набора реагентов:

В соответствии с
представленными данными диагностическая
чувствительность
набора реагентов АмплиСенс^®
Enterovirus 71-FL
(относительная чувствительность в
сравнении с использованным методом
сравнения) составляет для образцов СМЖ
и концентратов образцов воды не менее
93 % с доверительной вероятностью
90 %, для образцов фекалий не менее
96 % с доверительной вероятностью 90 %

Диагностическая
специфичность
набора реагентов АмплиСенс^®
Enterovirus 71-FL
(относительная чувствительность в
сравнении с использованным методом
сравнения) составляет для образцов СМЖ
и концентратов образцов воды не менее
93 % с доверительной вероятностью
90 %, для образцов фекалий не менее
96 % с доверительной вероятностью 90 %

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Работа должна проводиться
в лаборатории, выполняющей
молекулярно-биологические (ПЦР)
исследования биологического материала
на наличие возбудителей инфекционных
болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы
с микроорганизмами III–IV
групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней»,
СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические
требования к обращению с
медицинскими отходами» и методических
указаний МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с
материалом, содержащим микроорганизмы
I–IV групп патогенности».

При работе всегда
следует выполнять следующие требования:

• Следует рассматривать
  исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
  организовывать работу и хранение в
  соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
  работы с микроорганизмами III–IV
  групп патогенности (опасности) и
  возбудителями паразитарных болезней».

• Убирать и дезинфицировать
  разлитые образцы или реактивы, используя
  дезинфицирующие средства в соответствии
  с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
  микроорганизмами III–IV
  групп патогенности (опасности) и
  возбудителями паразитарных болезней».

• Лабораторный процесс
  должен быть однонаправленным. Анализ
  проводится в отдельных помещениях
  (зонах). Работу следует начинать в Зоне
  Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации
  и Детекции. Не возвращать образцы,
  оборудование и реактивы в зону, в которой
  была проведена предыдущая стадия
  процесса.

• Неиспользованные
  реактивы, реактивы с истекшим сроком
  годности, а также использованные
  реактивы следует удалять в соответствии
  с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10
  «Санитарно-эпидемиологические
  требования к обращению с
  медицинскими отходами».

ВНИМАНИЕ!
При удалении отходов после амплификации
(пробирок, содержащих продукты ПЦР)
недопустимо открывание пробирок и
разбрызгивание содержимого, поскольку
это может привести к контаминации
продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.

• Использовать и менять
  при каждой операции одноразовые
  наконечники для автоматических дозаторов
  с фильтром. Одноразовую пластиковую
  посуду (пробирки, наконечники) необходимо
  сбрасывать в специальный контейнер,
  содержащий дезинфицирующее средство,
  которое может быть использовано для
  обеззараживания медицинских отходов.

• Поверхности
  столов, а также помещения, в которых
  проводится постановка ПЦР, до начала
  и после завершения работ необходимо
  подвергать ультрафиолетовому облучению
  в
  течение 30 мин.

• Применять набор строго
  по назначению, согласно данной инструкции.

• Допускать к работе с
  набором только специально обученный
  персонал.

• Не использовать набор
  по истечении срока годности.

• Использовать
  одноразовые перчатки, лабораторные
  халаты, защищать глаза во время работы
  с образцами и реактивами. Тщательно
  вымыть руки по окончании работы.

• Избегать контакта с
  кожей, глазами и слизистой оболочкой.
  При контакте немедленно промыть
  пораженное место водой и обратиться
  за медицинской помощью.

Листы безопасности
материалов (MSDS
– material
safety
data
sheet)
доступны по запросу.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1. Комплект реагентов
   для экстракции РНК – «РИБО-сорб»
   (ТУ 9398-004-01897593-2008),
   «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008) или другие
   рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
   Роспотребнадзора.

2. Дополнительные
   материалы и оборудование для экстракции
   РНК – согласно инструкции к комплекту
   реагентов для экстракции РНК.

3. Бокс абактериальной
   воздушной среды (ПЦР-бокс) (например,
   «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные
   системы», Россия).

4. Центрифуга/вортекс
   (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

5. Автоматические дозаторы
   переменного объема (от 5 до 20 мкл, от 20
   до 200 мкл) (например,
   «Ленпипет», Россия).

6. Одноразовые наконечники
   с фильтром до 100 и до 200 мкл в штативах
   (например, Axygen, США).

7. Штативы для пробирок
   объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии
   с используемым амплификатором).

8. Холодильник от 2 до
   8 °С с морозильной камерой от минус
   24 до минус 16 °С.

9. Отдельный халат,
   шапочки, обувь и одноразовые перчатки
   по МУ 1.3.2569-09.

10. Емкость для сброса
    наконечников.

В случае
детекции по «конечной точке»:

1. Программируемый
   амплификатор (например, «Терцик»
   («ДНК-Технология», Россия),
   Gradient
   Palm
   Cycler
   (Corbett
   Research,
   Австралия), MaxyGene
   (Axygen,
   США), GeneAmp
   PCR
   System
   2700 (Applied
   Biosystems)).

2. Флуоресцентный
   ПЦР-детектор (например, AЛА-1/4
   (BioSan,
   Латвия), «Джин» («ДНК-Технология»,
   Россия)).

3. Одноразовые
   полипропиленовые пробирки для ПЦР
   (плоская крышка,
   нестрипованные):

а) объемом 0,2 мл (например,
Axygen, США) – для амплификаторов,
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,2 мл
(Gradient Palm Cycler, GeneAmp PCR System 2700, MaxyGene
и др.);

б) объемом 0,5 мл (например,
Axygen, США) – для амплификаторов,
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,5 мл
(«Терцик» и др.).

В случае
детекции в режиме «реального времени»:

1. Программируемый
   амплификатор с системой детекции
   флуоресцентного сигнала в режиме
   «реального времени» (например, Rotor-Gene
   3000/6000 (Corbett Research,
   Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия),
   iCycler
   iQ5 (Bio-Rad, США), Mx3000P (Stratagene, США), «ДТ-96»
   («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).

2. Одноразовые
   полипропиленовые пробирки для ПЦР:

а) объемом
0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные),
(например, Axygen,
США) для постановки в ротор на 36 пробирок
– при использовании приборов
для проведения ПЦР в режиме «реального
времени» с детекцией через дно пробирки
(например, Rotor-Gene).

б) объемом
0,2 мл (куполообразная крышка) (например,
Axygen,
США) – при использовании приборов
для проведения ПЦР в режиме «реального
времени» с детекцией через крышку
(например, iCycler
iQ5,
Mx3000P).

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Перед началом работы
следует ознакомиться с методическими
рекомендациями «Взятие, транспортировка,
хранение клинического материала для
ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН
ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2010 г.

Для проведения анализа
используют различные
типы биологического
материала (спинномозговая жидкость,
образцы фекалий) и образцы объектов
окружающей среды (концентраты образцов
воды) в соответствии с МУ 3.1.1.2363-08
«Эпидемиологический надзор и профилактика
энтеровирусной (неполио) инфекции».

Условия хранения
материала:

• при температуре от 2
  до 8 °С – в течение 1 суток;

• при температуре от
  минус 24 до минус 16 °С – в течение 1
  недели.

Допускается только
однократное замораживание-оттаивание
материала.

ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К
ЭКСТРАЦИИ РНК

Образцы спинномозговой
жидкости и
концентраты образцов воды не требуют
предварительной подготовки.

Образцы фекалий
требуют предварительной подготовки.

Подготовка образцов
проводится в соответствии с методическими
рекомендациями «Взятие, транспортировка,
хранение клинического материала для
ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН
ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2010 г.

ФОРМАТ FEP

СОСТАВ

Комплект реагентов
«ПЦР-комплект» вариант FEP/FRT-50
F – комплект
реагентов для
обратной транскрипции РНК, амплификации
фрагмента кДНК энтеровируса 71
типа (Enterovirus
71 типа) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
–
включает:

Комплект реагентов
рассчитан на проведение 55 реакций
амплификации, включая контроли.

К комплекту реагентов
прилагаются контрольные образцы этапа
экстракции:

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование
состоит из следующих этапов:

• Экстракция РНК из
  исследуемых образцов.

• Обратная транскрипция
  РНК и амплификация кДНК.

• Флуоресцентная детекция
  продуктов амплификации по «конечной
  точке».

• Интерпретация
  результатов.

Детальная информация
по процедуре проведения ПЦР-исследования
в зависимости от используемого
оборудования изложена в методических
рекомендациях по применению набора
реагентов для выявления РНК
энтеровируса 71 типа (Enterovirus
71 типа) в объектах окружающей среды и
биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс^®
Enterovirus
71-FL»,
разработанных ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора.

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Для экстракции РНК
используют комплект реагентов «РИБО-сорб»,
«РИБО-преп» или другие, рекомендованные
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора,
в соответствии с инструкцией к
используемому комплекту.

Экстракцию РНК из
каждого исследуемого образца проводят
в присутствии внутреннего контрольного
образца (ВКО
STI-87-rec⁹⁾).
В качестве отрицательного контроля
экстракции (ОК) используют ОКО.

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ
И АМПЛИФИКАЦИИ

ВНИМАНИЕ! При работе
с РНК необходимо использовать только
одноразовые стерильные пластиковые
расходные материалы, имеющие специальную
маркировку «RNase-free», «DNase-free».

Выбор пробирок для
амплификации зависит от используемого
амплификатора.

Для внесения в пробирки
реагентов, проб РНК и контрольных
образцов используют одноразовые
наконечники с фильтрами.

А. Подготовка пробирок для проведения
ОТ-ПЦР

Общий объем реакционной
смеси – 25 мкл, включая объем пробы РНК
– 10 мкл.

1. Компоненты реакционной
   смеси следует смешивать непосредственно
   перед проведением анализа. Смешивать
   реагенты из расчета на необходимое
   число реакций, включающее тестирование
   исследуемых и контрольных образцов,
   необходимо согласно расчетной
   таблице (см.
   табл. 1). Следует учитывать, что для
   тестирования даже одного исследуемого
   образца необходимо проводить постановку
   всех контролей этапа ОТ-ПЦР (положительного
   контроля (К+), отрицательного контроля
   (К-) и двух пробирок «Фон»).
   Рекомендуется смешивать реагенты для
   четного числа реакций с целью более
   точного дозирования.

2. Отобрать необходимое
   количество пробирок с учетом количества
   исследуемых образцов, контрольных
   образцов и пробирок
   «Фон». Тип пробирок,
   стрипов или плашек выбрать в зависимости
   от используемого прибора.

3. Для приготовления
   реакционных смесей
   и смесей для пробирок «Фон» необходимо
   в отдельной стерильной пробирке смешать
   ПЦР-смесь-FL
   EV71 /
   STI,
   ПЦР-буфер-C
   и RT—G—mix-2
   согласно
   таблице 1. Тщательно
   перемешать смесь на вортексе и осадить
   капли с крышек пробирок.

4. Приготовить 2 пробирки
   «Фон».
   Для этого внести
   по 15 мкл приготовленной смеси (без
   полимеразы (TaqF)
   и TM-Ревертазы (MMlv))
   в две пробирки «Фон»,
   добавить по 10 мкл К-,
   перемешать пипетированием. Сверху
   раскапать по 1 капле минерального
   масла для ПЦР
   (примерно 25 мкл).

5. В оставшуюся часть
   реакционной смеси
   добавить полимеразу
   (TaqF) и TM-Ревертазу
   (MMlv)
   в количестве,
   согласно
   таблице 1. Тщательно
   перемешать смесь на вортексе и осадить
   капли с крышки пробирки.

ВНИМАНИЕ!
Количество добавляемых в реакционную
смесь ферментов полимеразы
(TaqF)
и TM-Ревертазы (MMlv),
указанное в таблице
1, приведено с
учетом уже отобранных 30 мкл реакционной
смеси для двух пробирок «Фон».

Таблица 1

Схема приготовления
реакционных смесей

для проведения ОТ-ПЦР
с детекцией по «конечной точке»

1. Внести в оставшиеся
   пробирки по 15 мкл готовой реакционной
   смеси. Сверху раскапать по 1 капле
   минерального
   масла для ПЦР
   (примерно 25 мкл).

2. Используя
   наконечники с фильтрами,
   в пробирки с реакционной смесью добавить
   по 10 мкл РНК-проб,
   экстрагированных из исследуемых или
   контрольных проб этапа экстракции
   нуклеиновых кислот.
   Неиспользованные
   остатки реакционной смеси выбросить.

Внимание!
При добавлении
РНК-проб,
экстрагированных с помощью комплекта
реагентов «РИБО-сорб», необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную
смесь для ПЦР.

1. Поставить контрольные
   реакции амплификации:

а) отрицательный
контроль (К-) –
внести в приготовленную пробирку с
реакционной смесью 10 мкл
К-;

б) положительный
контроль (К+) –
внести в
приготовленную пробирку
10 мкл К+
EV71
/ STI.

Рекомендуется перед
постановкой в амплификатор осадить
капли со стенок пробирок кратким
центрифугированием на центрифуге/вортексе
(1-3 с).

Б. Проведение ОТ-ПЦР

ВНИМАНИЕ!
Пробы амплифицировать сразу после
соединения реакционной смеси и РНК-пробы
и контролей! Время внесения проб в
реакционную смесь и запуск реакции на
приборе не должно превышать 10-15 минут.

1. Запустить на амплификаторе
   соответствующую программу
   термоциклирования (см. табл. 2).

Таблица 2

Программа амплификации

1. По окончании выполнения
   программы приступить к флуоресцентной
   детекции.

ФЛУОРЕСЦЕНТАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ
АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»

Детекцию проводят с
помощью флуоресцентного ПЦР-детектора
(согласно инструкции к используемому
прибору) путем измерения интенсивности
флуоресцентного сигнала по двум каналам:

• по каналу для флуорофора
  FAM¹¹⁾
  (или аналогичному, в зависимости от
  модели прибора) регистрируется сигнал
  о накоплении продукта амплификации
  кДНК ВКО.

• по каналу для флуорофора
  JOE⁶⁾
  (или аналогичному, в зависимости от
  модели прибора) регистрируется сигнал
  о накоплении продукта амплификации
  фрагмента кДНК энтеровируса 71
  типа (Enterovirus
  71 типа).

ВНИМАНИЕ!
До проведения детекции в программное
обеспечение ПЦР-детектора должны быть
внесены и сохранены соответствующие
настройки – см. вкладыш к ПЦР-комплекту,
а также методические рекомендации по
применению набора реагентов для выявления
РНК энтеровируса 71 типа (Enterovirus
71 типа) в объектах окружающей среды и
биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс^Ò
Enterovirus
71-FL»,
разработанные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты
интерпретируют на основании данных об
уровне флуоресцентного сигнала
относительно фона по соответствующим
каналам для контрольных образцов и проб
РНК, выделенных из исследуемых образцов.
Интерпретация производится автоматически
с помощью программного обеспечения
используемого прибора. Принцип
интерпретации результатов представлен
в таблице 3:

Таблица 3

Интерпретация
результатов ПЦР-исследования

Результат ПЦР-исследования
считается достоверным, если получены
правильные результаты для положительного
и отрицательного контролей амплификации
и отрицательного контроля экстракции
РНК, в соответствии с таблицей 4.

Таблица 4

Результаты для
контролей различных этапов ПЦР-исследования

ВНИМАНИЕ!

1. Если для положительного
   контроля ПЦР (K+)
   сигнал по каналу для флуорофора JOE
   ниже порогового значения положительного
   результата, необходимо повторить ОТ-ПЦР
   и детекцию для всех образцов, в которых
   не обнаружена РНК Enterovirus 71
   типа.

2. Если для отрицательного
   контроля экстракции РНК (ОК) и/или
   отрицательного контроля ПЦР (К-) сигнал
   по каналу для флуорофора JOE
   выше порогового значения положительного
   результата, необходимо повторить
   ПЦР-исследование для всех образцов, в
   которых обнаружена РНК Enterovirus 71
   типа,
   начиная с
   этапа экстракции РНК.

ФОРМАТ FRT

СОСТАВ

Комплект реагентов
«ПЦР-комплект» вариант FEP/FRT-50
F –
комплект реагентов для
обратной транскрипции РНК, амплификации
фрагмента кДНК энтеровируса 71
типа (Enterovirus
71 типа) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
– включает:

Комплект реагентов
рассчитан на проведение 55 реакций
амплификации, включая контроли.

К комплекту реагентов
прилагаются контрольные образцы этапа
экстракции:

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование
состоит из следующих этапов:

• Экстракция РНК из
  исследуемых образцов

• Обратная транскрипция
  РНК и амплификация кДНК с
  гибридизационно-флуоресцентой детекцией
  в режиме «реального времени».

• Анализ и интерпретация
  результатов.

Детальная информация
по процедуре проведения ПЦР-исследования
в зависимости от используемого
оборудования изложена в методических
рекомендациях по применению набора
реагентов для выявления РНК энтеровируса
71 типа (Enterovirus 71
типа) в объектах окружающей среды и
биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс^®
Enterovirus
71-FL», разработанных ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора.

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Для экстракции РНК
используют комплект реагентов «РИБО-сорб»,
«РИБО-преп» или другие, рекомендованные
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора,
в соответствии с инструкцией к
используемому комплекту.

Экстракцию РНК из
каждого исследуемого образца проводят
в присутствии внутреннего контрольного
образца (ВКО
STI-87-rec¹²⁾).
В качестве отрицательного контроля
экстракции (ОК) используют ОКО.

ПРОВЕДЕНИЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И
АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

ВНИМАНИЕ! При работе
с РНК необходимо использовать только
одноразовые стерильные пластиковые
расходные материалы, имеющие специальную
маркировку
«RNase-free», «DNase-free».

Выбор пробирок для
амплификации зависит от используемого
амплификатора.

Для внесения в пробирки
реагентов, проб РНК и контрольных
образцов используются одноразовые
наконечники с фильтрами.

А. Подготовка пробирок для проведения
ОТ-ПЦР

Общий объем реакционной
смеси – 25 мкл, включая объем пробы РНК
– 10 мкл.

1. Компоненты реакционных
   смесей следует смешивать непосредственно
   перед проведением анализа. Смешивать
   реагенты из расчета на необходимое
   число реакций, включающее тестирование
   исследуемых и контрольных образцов,
   необходимо согласно расчетной
   таблице (см.
   табл. 5). Следует учитывать, что для
   тестирования даже одного исследуемого
   образца необходимо проводить постановку
   всех контролей этапа ОТ-ПЦР (положительного
   (К+) и отрицательного (К-) контролей).
   Рекомендуется
   смешивать реагенты для четного числа
   реакций с целью более точного дозирования.

2. Отобрать необходимое
   количество пробирок с учетом количества
   исследуемых и контрольных образцов.
   Тип пробирок, стрипов или плашек выбрать
   в зависимости от используемого прибора.

3. Для приготовления
   реакционных смесей
   необходимо в
   отдельной стерильной пробирке смешать
   ПЦР-смесь-FL
   EV71
   / STI,
   ПЦР-буфер-C,
   RT—G—mix-2,
   полимеразу
   (TaqF), TM-Ревертазу (MMlv)
   в количестве
   согласно
   таблице 5. Тщательно
   перемешать смесь на вортексе и осадить
   капли с крышек пробирок.

4. Внести в
   отобранные пробирки по 15 мкл готовой
   реакционной смеси.

Таблица 5

Схема приготовления
реакционных смесей

для ОТ-ПЦР
с детекцией в режиме «реального времени»

1. Используя
   наконечники с фильтрами,
   в пробирки с реакционной смесью добавить
   по 10 мкл РНК-проб,
   экстрагированных из исследуемых или
   контрольных проб этапа экстракции
   нуклеиновых кислот.
   Неиспользованные
   остатки реакционной смеси выбросить.

Внимание!
При добавлении
РНК-проб,
экстрагированных с помощью комплекта
реагентов «РИБО-сорб», необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную
смесь для ПЦР.

1. Поставить контрольные
   реакции
   амплификации:

а) отрицательный
контроль (К-) – внести
в приготовленную пробирку с реакционной
смесью 10 мкл К-;

б) положительный
контроль (К+) —
внести в приготовленную
пробирку с реакционной смесью 10 мкл
К+.

Рекомендуется перед
постановкой в амплификаторы планшетного
типа осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на
центрифуге/вортексе (1-3 с).

Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме
«реального времени»

ВНИМАНИЕ!
Пробы амплифицировать сразу после
соединения реакционной смеси и РНК-пробы
и контролей! Время внесения проб в
реакционную смесь и запуск реакции на
приборе не должно превышать 10-15 минут.

1. Запрограммировать
   прибор (амплификатор с системой детекции
   в режиме «реального времени») для
   выполнения соответствующей программы
   амплификации и детекции флуоресцентного
   сигнала (см. таблицу 6 и Методические
   рекомендации по применению набора
   реагентов для выявления РНК энтеровируса 71
   типа (Enterovirus
   71 типа) в объектах окружающей среды и
   биологическом материале методом
   полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
   гибридизационно-флуоресцентной
   детекцией «АмплиСенс^Ò
   Enterovirus
   71-FL»).

Таблица 6

Программа амплификации
для приборов роторного¹⁴⁾
и планшетного¹⁵⁾
типов

Детекция флуоресцентного
сигнала назначается по двум каналам –
для флуорофоров FAM¹⁶⁾
и JOE¹¹⁾.

1. Установить пробирки
   в ячейки реакционного модуля прибора.

2. Запустить выполнение
   программы амплификации с детекцией
   флуоресцентного сигнала.

3. По окончании выполнения
   программы приступить к анализу и
   интерпретации результатов.

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ результатов
проводят с помощью программного
обеспечения прибора,
используемого для проведения ПЦР c
детекцией в режиме «реального времени».
Анализируют кривые накопления
флуоресцентного сигнала по двум каналам:

• по каналу для флуорофора
  FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий
  о накоплении продукта амплификации
  кДНК ВКО,

• по каналу для флуорофора
  JOE
  регистрируется сигнал, свидетельствующий
  о накоплении продукта амплификации
  фрагмента кДНК энтеровируса 71
  типа (Enterovirus
  71 типа).

Результаты интерпретируют
на основании наличия (или отсутствия)
пересечения кривой флуоресценции с
установленной на соответствующем уровне
пороговой линией, что определяет наличие
(или отсутствие) для данной пробы значения
порогового цикла
«Ct»
в соответствующей графе в таблице
результатов.

Результаты интерпретируют
в соответствии с таблицей
7 и вкладышем,
прилагаемым к набору реагентов.

Клиническая интерпретация
результатов лабораторного исследования
различных типов
клинического материала проводится в
соответствии с действующей
нормативно-методической документацией.

Таблица 7

Интерпретация
результатов ПЦР-исследования

ВНИМАНИЕ!
Граничные значения Ct
указаны во вкладыше, прилагаемом к
набору реагентов. См. также методические
рекомендации по применению набора
реагентов для выявления
РНК энтеровируса 71
типа (Enterovirus 71
типа) в объектах
окружающей среды и
в биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс^®
Enterovirus
71-FL»,
разработанные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора.

Результат ПЦР-исследования
считается достоверным, если получены
правильные результаты для положительного
и отрицательного контролей амплификации
и отрицательного контроля экстракции
РНК, в соответствии с таблицей 8.

Таблица 8

Результаты контролей
различных этапов ПЦР-исследования

ВНИМАНИЕ!

1. Если для положительного
   контроля этапа ПЦР (К+) значение порогового
   цикла Ct
   по каналу для
   флуорофора JOE
   отсутствует или превышает граничное
   значение, необходимо повторить ОТ-ПЦР
   и детекцию для всех образцов, в которых
   не была выявлена РНК Enterovirus
   71
   типа.

2. Если для отрицательного
   контроля экстракции РНК (ОК) и/или
   отрицательного контроля ПЦР (К–) по
   каналу для флуорофора JOE
   значение порогового цикла
   Ct
   меньше граничного значения, необходимо
   повторить ПЦР-исследование для всех
   образцов, в которых обнаружена РНК
   Enterovirus
   71 типа,
   начиная с
   этапа экстракции РНК.

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ
И ХРАНЕНИЯ

Срок
годности.
9 мес.
Набор реагентов с истекшим сроком
годности применению не подлежит.
Срок годности вскрытых реагентов
соответствует сроку годности, указанному
на этикетках для невскрытых реагентов,
если в инструкции не указано иное.

Транспортирование.
Набор
реагентов транспортировать при
температуре от 2 до 8 °С
не более 5 сут. «ПЦР-комплект»
вариант FEP/FRT-50 F
при
получении разукомплектовать в соответствии
с указанными температурами хранения.

Хранение. Набор
реагентов хранить при температуре от
2 до 8 °С.
ПЦР-смесь-FL
EV71
/ STI,
ПЦР-буфер-C,
RT-G-mix-2,
полимеразу (TaqF), TM-Ревертазу (MMlv)
хранить при температуре от минус 24 до
минус 16 °С. ПЦР-смесь-FL
EV71
/ STI
хранить в защищенном от света месте.

Рекламации по качеству
набора реагентов «АмплиСенс^®
Еnterovirus 71-FL»
направлять в адрес
ООО «ИнтерЛабСервис» (115035,
г. Москва, ул. Садовническая, д. 20/13,
стр. 2), в отдел
рекламаций,
организации обучения и контроля
качества
(тел.
(495) 664-28-84, (495)
925-05-54, факс (495) 664-28-89,
e-mail:
products@)¹⁷⁾

СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ
ПРОДУКЦИИ

Лист вносимых изменений

1⁾
В соответствии
с Директивой Европейского Союза
98/79/EC.

2⁾
Количество геномных эквивалентов
микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца
исследуемого материала.

3⁾
В качестве метода сравнения использовался
набор реагентов «АмплиСенс® Enterovirus-FL»
№ ФСР 2008/02264 от 16.11.2011 с проведением
генотипирования позитивных образцов
методом прямого секвенирования по
методике Nix
et
all.
2006.

4⁾
Были использованы 12 образцов СМЖ от
пациентов из очагов групповой
заболеваемости EV71
и 18 модельных образцов СМЖ со
среднеклиническими концентрациями
EV.
Отрицательные по содержанию EV71
образцы СМЖ получены от пациентов с
серозными и гнойными менингитами в
период 2011-2013гг.

5⁾
Содержание РНК EV71
в дискордантных образцах (11 образцов
СМЖ, 8 образцов фекалий и 8 образцов
концентратов воды) было подтверждено
методом прямого секвенирования продукта
амплификации, что позволяет связывать
их появление с более низкой аналитической
чувствительностью метода сравнения
(Nix
et
all.
2006.)

6⁾
Были использованы 36 образцов фекалий
от пациентов из очагов групповой
заболеваемости EV71
и 30 модельных образцов фекалий со
среднеклиническими концентрациями
EV.
Отрицательные по содержанию EV71
образцы фекалий получены от пациентов
с острыми кишечными инфекциями (n=200)
и клинически здоровых лиц (n=150)
в период 2011-2013гг.

7⁾
Были использованы 30 модельных образцов
концентратов воды (фильтровальный
модуль с мембранами с ^«+»
зарядом до 40мВ/см²,
элюция beef extract (Sigma
Aldrich,
США)), контаминированных среднестатистическими
концентрациями EV71,
характерными для содержания EV
в сточных водах, и 70 концентратов воды,
отрицательных по содержанию EV71.

8⁾
Реагент используется при применении
амплификаторов без термостатируемой
крышки (например, «Терцик»,
«ДНК-Технология», Россия).

9⁾
В случае применения комплекта реагентов
«РИБО-сорб» использовать ВКО STI-87-rec
объемом 10 мкл на пробу.

10⁾
Число исследуемых
образцов + контроль этапа экстракции
РНК + 2 контроля этапа ОТ-ПЦР + 2 пробирки
«Фон» + запас на
один образец
(N+1+2+2+1,
где N-количество
исследуемых образцов).

11⁾
Название каналов
детекции для соответствующего прибора
см. в методических рекомендациях к
набору реагентов.

12⁾
В случае применения комплекта реагентов
«РИБО-сорб» использовать ВКО STI-87-rec
объемом 10 мкл на пробу.

13⁾
Число исследуемых
образцов + контроль этапа экстракции
РНК + 2 контроля этапа ОТ-ПЦР +
запас на один образец
(N+1+2+1,
где N-количество
исследуемых образцов).

14⁾
Например, Rotor-Gene
3000,
Rotor-Gene 6000, Rotor-Gene Q и
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора в методических
рекомендациях по применению данного
набора реагентов

15⁾
Например, iCycler iQ5,
Mx3000P,
«ДТ-96» и рекомендованные ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора в
методических рекомендациях по применению
данного набора реагентов.

16⁾
Название каналов
детекции для соответствующего прибора
см. в методических рекомендациях к
набору реагентов.

17⁾
Отзывы и предложения о продукции
«АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив
анкету потребителя на сайте:
www.amplisens.ru.

«АмплиСенс® Human enterovirus-FL» — набор реагентов для качественного определения РНК энтеровирусов человека (Human enterovirus) видов/кластеров А, В, С, D (Human coxsackievirus A, Human coxsackievirus В, Human echovirus, Human poliovirus, Human enterovirus 68-71, 73-78, 89-91), без дифференцировки между ними, в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией продуктов амплификации.
Возможность детекции непосредственно в процессе реакции в «режиме реального времени» (формат FRT) или по окончании амплификации (формат FEP).

Аналитическая чувствительность:
Спинномозговая жидкость (СМЖ), концентраты образцов воды, мазки из респираторного тракта — 5х10^3 ГЭ/мл
Фекалии — 1х10^4 ГЭ/мл

Биоматериал: спинномозговая жидкость, фекалии, объекты окружающей среды (концентраты образцов воды), мазки из респираторного тракта.

Дополнительно требуются: набор для выделения НК РИБО-преп и набор для проведения обратной транскрипции «Реверта-L».

Контроли:
— контроли эффективности экстракции НК (ОКО)
— контроли прохождения ПЦР (К+, K-)
— внутренний контрольный образец (ВКО)

Амплификаторы:
Rotor-Gene 3000/6000 Corbett Research, Австралия
Rotor-Gene Q Qiagen, Германия
CFX96, iCycler iQ5 Bio-Rad, США
ДТ-96, ДТпрайм, ДНК-Технология, Россия

Регистрация в РФ: РУ № РЗН 2021/13712

Общий срок годности 12 месяцев.